病毒定量試驗
病毒定量研究是利用細胞培養技術增殖病毒并測定病毒含量，也是對病毒感染性的測定。對病毒感染性的研究，也必須以細胞培養法為基礎。測定病毒感染性強弱常用的方法有兩種，一是TCID50組織細胞感染量測定法，二是蝕斑形成法。
（一）TCID50病毒感染性測定法
50％組織細胞培養感染量（50% tissue culture infectious dose,TCID50）測定法是測定病毒感染培養細胞后，引起50％細胞發生感染的最小病毒量。一般是將病毒10倍系列稀釋后，分別接種于細胞，經一定時間后觀察細胞病變、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50％細胞的病毒量為終點，統計學方法計算出50％組織細胞感染量（TCID50)。該方法是用半數感染量估計病毒感染性的強弱及含量，但不能準確測定感染性病毒顆粒的數量。這里介紹微量培養法測定TCID50。
【材料】
1．待測病毒液麻疹病毒。
2．細胞Vero細胞。
3．培養液含10% FCS的MEM或RPMI 1640生長液及含2% FCS的MEM或RPMI 1640維持液。
4．消化液0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 1：1混合液。
5. 96孔組織培養板及微量移液器、吸管、試管等。
【方法】
1．選擇經24～48小時培養生長旺盛、成層良好的Vero細胞一瓶，傾棄生長液，加入消化液5m1,37℃消化10～15分鐘后，棄去消化液，加適量含10% FCS的MEM或RPMI 1640生長液分散細胞，使細胞懸液濃度為4x105/ml。用微量移液器將細胞懸液加入無菌％孔培養板中，每孔0.1 ml。
2．將培養板置于37℃,5% CO2孵箱中培養12～18小時，使細胞生長成單層。
3．將待測病毒液在試管內用含2% FCS的MEM或RPMI 1640維持液作10倍系列稀釋，使病毒液濃度分別為10-1,10-2,10-3 ......10-8。稀釋方法見表8-2。
4．棄去培養板中的生長液，各孔細胞用Hanks液洗滌2次，每孔加入不同稀釋度的病毒液0.1ml，每個稀釋度4個孔。4個對照孔加入維持液0.1m1,37℃吸附1小時，然后各孔再加入維持液0.1ml，輕輕搖勻，37℃,5% CO2下靜止培養。倒置顯微鏡下逐日觀察各孔細胞病變，連續觀察4天。
【結果】
細胞100％出現CPE判為（4+);50％～75％細胞出現CPE為（3+) ;25％～50％細胞CPE為（2+) ;25％以內細胞CPE為（+）；無CPE為（-）。
凡能使50％的細胞出現CPE的最高病毒稀釋度，即為50％組織培養感染量（TCID5O)。TCID50的計算通常按Reed-Munch計算法（表8-3）進行，舉例如下：
表中10-5的病變孔累積陽性百分率高于50%，而10-6的陽性百分率低于50%,50％陽性率終點分布于兩者之間，計算公式為：
高于50％感染百分數的病毒稀釋度的對數（即1g10-5）為-5.0，故TCID50=5.0+0.2=5.2（即10-5.2），也就是說，此病毒的10-5.2的濃度，以0.1 ml接種細胞孔后，即有50％細胞病變的可能性。故該病毒TCID50=10-5.2/0.1 ml。
（二）病毒蝕斑形成試驗
蝕斑形成試驗（plaque forming assay）是目前測定病毒感染性最精確的方法之一，可以測得活病毒顆粒數。該方法是Dulbecc。和Vogt于1954年創建的。原理是將一定稀釋度的病毒懸液加入到單層細胞培養瓶中，吸附一定時間后再覆蓋一層融化的半固體營養瓊脂，使病毒在單層細胞培養層中不易擴散。結果每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶，此即蝕斑。用中性紅染色，活細胞著色，而感染灶中的死細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑。每個蝕斑是由一個有感染性活病毒顆粒復制而形成的，故稱為蝕斑形成單位（plaque forming unit,PFU )，病毒懸液中含有的感染性病毒量，以每毫升的空斑形成單位來表示，即PFU/ml。
【材料】
1.待測病毒液麻疹病毒約106TCID50/ml。
2．細胞 Vero細胞單層培養平皿（60mm）或單層細胞培養瓶18支。
3．含2% FCS的MEM（或RPMI 1640）維持液、Hanks液。
4. 1.5％瓊脂覆蓋培養基
A液（50ml):10xMEM（不含酚磺酞)9.5ml,FCS 5.0m1,7.5% NaHC03 2.9ml及滅菌蒸餾水32.6ml，無菌配制，置37℃水浴箱預溫。
B液（50ml)：瓊脂1.5g溶于50.0ml蒸餾水中。121℃高壓滅菌15分鐘后，置56℃水浴箱中預溫。
A,B混合液：A液、B液等量混合，現用現配，保溫42℃左右待用。
5. 1％中性紅瓊脂培養基（C液）:10xMEM 5m1、瓊脂0.75g,1％中性紅及44ml去離子水，121℃高壓滅菌15分鐘，50℃水浴預溫，用前加7.5% NaHC03 1.5m1。
【方法】
1．病毒的稀釋與接種取9支小試管，將待檢病毒用維持液10倍系列稀釋，從10-5之后加半log稀釋到10-7，具體方法見表8-4。
將培養24小時的單層細胞各平皿（或培養瓶）內生長液棄掉，將病毒液接種于細胞上。按不同倍數稀釋的病毒液10-7、10-6.5、10-6、10-5.5、10-5和維持液對照等6組接種，每組設3支平皿（或培養瓶），每皿（瓶）接種0.5 ml，充分鋪滿并吸附1小時。每巧分鐘搖動1次使之均勻地接觸細胞。
2.覆蓋瓊脂培養基將42℃預溫的覆蓋培養基（A,B液等量混合）迅速吸取4～5 ml加入各細胞培養皿（或瓶）中鋪蓋于已接種病毒的單層細胞表面，待瓊脂凝固后，將瓊脂層向上，置37℃培養3～4天并顯微鏡下逐日觀察。
3．染色并計數空斑培養第4天向各培養皿（瓶）中加50℃預溫的1%中性紅瓊脂培養基（C液）2ml，待凝固后，置37℃孵箱內培養數小時（或過夜）后，肉眼或鏡下計數空斑。由于中性紅可使活細胞著色，病毒感染灶則形成無色空斑。
【結果判定】
計數時選擇空斑不融合、分散呈單個、數目在30～100個／皿（瓶）的培養器，分別計算各病毒稀釋度的空斑數，并求3瓶平均值，按下列公式計算。
【注意事項】
1．將病毒液不同倍數稀釋后，各管要混勻，使感染病毒的培養細胞能出現可數而不密集的空斑，便于準確計算。
2.覆蓋瓊脂培養基要維持在42℃左右，不能過涼和過熱，過涼瓊脂易凝，過熱易使病毒失活。